一文概述間充質幹細胞(MSC)的三系分化及其培養Protocol

間充質幹細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）具有獨特的生物學特性和治療潛能，正在成爲疾病研究領域的“新星”，研究熱度持續不減。MSC涉及相關研究較多，如多發性硬化症、關節炎、神經病理性疼痛、腸道疾病等，是移植和自身免疫系統疾病領域的研究熱點。

2014-2024年MSC領域發表論文數量統計，數據來自Pubmed

間充質幹細胞 （MSC） 是源自中胚層的具有高度自我更新、多譜系分化潛力的多能幹細胞，廣泛存在於全身多種組織，具有易分離、易獲取的優點，可在體外進行分化擴增培養。

MSC是腫瘤治療及基因傳遞研究、功能基因組學、藥物篩選、高通量篩選和毒理學的優秀工具。國際細胞治療協會（ISCT）將人源MSC定義爲：

在標準培養條件下，爲貼壁生長；

需表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面標記；

在體外可以分化爲成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞。

間充質幹細胞來自多種細胞或組織，如骨髓、脂肪組織、外周血、胎盤組織、牙髓等。同樣MSC也可以分化成多種細胞類型，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞、基質細胞等。

MSC來源及分化（源自參考文獻）

值得注意的是，間充質幹細胞的分化潛力可能會因幹細胞來源、擴增條件及其培養微環境而異。其中三系分化是MSC培養擴增的重點。三系分化通常指成骨、成脂和成軟骨分化。爲了更好地理解MSC的三系分化，本文初步總結了MSC三系分化的大概過程以及一些標誌物對應的鑑定方法。

成骨分化

MSC在多種細胞因子的刺激及其他特點理化環境中，可以定向分化爲骨原細胞。然後骨原細胞進一步分化成骨細胞前體細胞，進入快速增殖期。成骨細胞在此階段合成和分泌有機基質，形成類骨質（主要爲I型膠原蛋白），特徵物是鹼性磷酸酶，是成骨細胞分化成熟的早期標誌；鹼性磷酸酶經固藍染色後在顯微鏡下呈現藍色，未分化的細胞則無明顯顏色。

成熟的成骨細胞表達ECM鈣化相關蛋白。長時間的成骨誘導使鈣離子以鈣鹽方式沉澱下來，形成“骨結節”。骨結節可通過茜素紅染色（茜素紅和鈣發生顯色反應，產生一種深紅色化合物），把外面沉積的鈣結節染成深紅色，通過着色物面積和深淺來表示成骨分化的強弱。

不同來源的MSC成骨分化鑑定

成軟骨分化

首先MSC聚集成團，成團的中間細胞經分裂分化轉變成一種大而圓的細胞，即成軟骨細胞。成軟骨細胞產生基質和纖維（主要爲 II型膠原蛋白） ，通過免疫組化觀察II型膠原蛋白的表達情況。

一般用阿利新藍鑑定成軟骨細胞分化結果。阿利新藍屬於鹼性染料，可以與細胞內的核酸結合，使細胞核呈深藍色。同時，阿利新藍與軟骨基質中的多糖結合，使軟骨細胞和基質呈淺藍色。

不同來源的MSC成軟骨分化鑑定

成脂分化

MSC成脂分化有兩個階段，先是分化爲脂肪前體細胞，接着在特定刺激影響下（如C/EBPs和PPAR-γ）分化爲脂肪細胞。

細胞在胞漿中不斷積累脂肪滴，並不斷變大。利用油紅O染色後，在顯微鏡下爲紅色。未分化的細胞則無明顯顏色。

不同來源的MSC成軟骨分化鑑定

各種因素都會影響分化潛力。如培養環境、生長因子以及其他細胞的存在，都會影響分化過程。特定的信號分子，例如骨形態發生蛋白（BMP）或Wingless相關整合位點（Wnt），可以分別促進幹細胞分化爲骨細胞或神經細胞。

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參考文獻 ：

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