農林1區-if9+南昌大學:紅芸豆多糖調節腸道菌羣和脂質代謝減輕2型糖尿病大鼠的高血糖和高血脂

本公衆號已與浙江慧通測評動物實驗中心搭建緊密的合作關係：該動物中心已獲得動物使用許可，如您需要含藥血清製備-成分分析、灌胃給藥、造模、藥理、毒理以及相關實驗（sci）外包服務，歡迎聯繫我們！

微科盟原創微文，歡迎轉發轉載。

導讀

從紅芸豆（RK）中提取的粗多糖在2型糖尿病（T2DM）小鼠中顯示出顯著的抗糖尿病活性，但其潛在機制和核心功能成分尚未被闡明。本研究通過血清代謝組學和高通量測序研究RK的抗糖尿病作用和機制。此外，我們通過評估2型糖尿病大鼠血糖和血脂穩態的改善情況，確定了關鍵成分。我們的數據表明，RK可以緩解鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠高血糖、高血脂症狀。RK不僅通過調節不飽和脂肪酸的生物合成來改善代謝紊亂，而且通過選擇性地富集擬桿菌屬、考拉桿菌屬、琥珀酸弧菌、布勞特氏菌屬等關鍵屬來改變腸道微生物羣組成。我們進一步發現純化多糖（RKP）被鑑定爲RK中的關鍵生物功能成分。我們目前的研究證明，RKP是2型糖尿病患者潛在的有效膳食補充劑。

亮點：

1. 紅芸豆粗多糖具有抗糖尿病作用；

2. RK調節不飽和脂肪酸的生物合成，富集關鍵菌屬；

3. 純化多糖(RKP)被鑑定爲其關鍵生物功能成分；

4. RKP可作爲2型糖尿病患者的有效膳食補充劑。

論文ID

原名：Polysaccharides from Red Kidney Bean Alleviating Hyperglycemia and Hyperlipidemia in Type 2 Diabetic Rats via Gut Microbiota and lipid Metabolic Modulation

譯名：紅芸豆多糖通過調節腸道菌羣和脂質代謝減輕2型糖尿病大鼠的高血糖和高血脂

期刊：Food Chemistry

IF：9.231

發表時間：2022.10

通訊作者：黃曉君

通訊作者單位：南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室

多糖提取方法：紅芸豆是從當地超市購買的。將粗多糖完全溶解在蒸餾水中，並基於靜態吸附試驗，用JK008大孔樹脂純化溶液，以獲得紅芸豆（RKP）的純多糖。中性糖含量通過苯酚-硫酸法測定。根據硫酸鋇-巴唑法測定了尿酸含量。通過高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法測定RKP的分子量（MW）。RKP的單糖組成通過高效陰離子交換色譜結合脈衝安培檢測（HPAEC-PAD）測定

實驗結果

1. RK對血糖穩態和血脂的影響

高血糖和高血脂是T2DM最常見的症狀，因此改善糖穩態和脂質代謝對改善T2DM至關重要。本研究結果表明，與對照組大鼠相比，糖尿病大鼠的血清空腹血糖（FBG）、糖基化血清蛋白GSP、曲線下面積AUC、非酯化脂肪酸NEFA、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）顯著升高（p<0.01）（圖1A-H）。HDL-C的增加可能與HFD有關，在HFD條件下，大鼠需要更多的HDL-C來轉運脂質。然而，低劑量RK（RKL）、中劑量RK（RKM）、高劑量RK（RKH）和二甲雙胍可顯著降低2型糖尿病大鼠血清GSP、NEFA、TC、TG、LDL-C水平（p<0.01）。給予RKL、RKM和二甲雙胍4周可顯著降低2型糖尿病大鼠的AUC水平（p<0.05）。雖然所有處理組（Met、RKL、RKM、RKH）在改變空腹血糖方面表現出不同的效率（1-4周）（圖S1A），但只有RKM在最後一週顯著降低了FBG水平（圖1A）。RKM組大鼠體重明顯高於糖尿病（DM）組（圖S1B）。這些結果表明，補充RKM可有效改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖穩態和血脂。

圖1 RK對2型糖尿病大鼠葡萄糖穩態和血脂的影響

對（A）空腹血糖（FBG），（B）糖基化血清蛋白（GSP），（C）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）曲線下面積（AUC），（D）非酯化脂肪酸（NEFA），（E）總膽固醇（TC），（F）甘油三酯（TG）、（G）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和（H）低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）的影響。採用Tukey事後檢驗的單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。*與CON組相比，p<0.05，**p<0.01；#與DM組相比，p<0.05，##p<0.01。

2. RK對胰島素抵抗和胰腺病理的影響

血清胰島素水平，HOMA-IR通常用於評估胰島β細胞功能，以反映胰島素抵抗的水平。如圖2A、B、D所示，2型糖尿病大鼠表現爲嚴重的囊泡變性、β細胞損傷、胰島素抵抗（p<0.01）。給予RKL和RKM可減輕胰島壞死和β細胞損傷。RKM使胰島素濃度略有升高。此外，RKH可降低HOMA-IR水平。

我們進一步研究各組胰島素受體(IR)、胰島素受體底物1 (IRS-1)、胰島素受體底物2 (IRS-2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)和葡萄糖轉運蛋白2 (GLUT-2) mRNA表達水平(圖S2)，建立基本生化指標與各組IR、IRS-1、IRS-2、PI3K、AKT、GLUT-2 mRNA表達水平的Spearman相關性(圖2C)。結果表明，與DM組相比，RKM處理組IR、IRS-1、IRS-2、PI3K、GLUT-2的mRNA表達水平增加（圖S2）。IR、IRS-1和AKT的mRNA表達水平與HOMA-IR呈顯著負相關，而IRS-2、PI3K和GLUT-2與所有基本生化指標呈弱相關。這一結果可能表明，RK通過增加IR、IRS-1 mRNA的表達，輕微緩解了胰島素抵抗。

圖2 RK對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗和胰腺組織病理學的影響

RK對（A）胰島素濃度、（B）胰島素抵抗（HOMA-IR）的影響。（C）2型糖尿病大鼠胰島素受體（IR）、胰島素受體底物1（IRS-1）、胰島素受體底物2（IRS-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和葡萄糖轉運蛋白2（GLUT-2）的mRNA表達水平與10項生化指標之間的Spearman相關性。R值由漸變色表示，其中藍色和粉紅色單元格分別表示正相關和負相關；*p<0.05，**p<0.01。（D）實驗中胰腺的組織病理學特徵。胰腺組織用H&E（200×）染色。採用Tukey事後檢驗的單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。*與CON組相比，p<0.05，**p<0.01；#與DM組相比，p<0.05，##p<0.01。

3. RK對血清代謝譜的影響

我們進行PCA以顯示不同組之間的代謝差異。PCA得分圖顯示，在正離子和負離子模式下，正常、糖尿病和RK處理樣本之間存在明顯差異。重要的是，RKM處理組的恢復效果最大（圖3C-D），這表明RKM在T2DM中具有有效的緩解作用。

OPLS-DA分析用於研究整體代謝變化，並用於鑑別CON組和DM組之間投影變量重要性(VIP)大於1的重要代謝物 (圖3A-B)。然後，我們使用顯著代謝物（CON組和DM組之間的VIP>1，p<0.05和倍數變化（FC）>2）進行化學相似性富集分析（ChemRICH）。飽和溶血磷脂酰膽鹼、磷脂酰乙醇胺、羥二十碳三烯酸（HETrE）、肉鹼、膽酸、磷脂酰膽鹼和飽和脂肪酸（FA）的簇增加，而T2DM患者的不飽和溶血磷脂酰膽鹼簇減少。其他簇（飽和溶血磷脂、不飽和溶血血磷脂和不飽和脂肪酸）包含顯著增加和減少的代謝物。11個簇與53個顯著變化的代謝物相關（p<0.05），如圖S3和表S2所示。爲了進一步評估RK對2型糖尿病大鼠血清代謝物的調節，我們根據53種代謝物構建了維恩圖和熱圖（圖3E-G，表S2）。所有處理組（RKL、RKM、RKH、Met）均顯著降低了11種代謝物（與DM組相比，p<0.05，VIP>1）（圖3F）。粗多糖處理（RKL、RKM、RKH）顯著降低了8種代謝物（與DM組相比，p<0.05，VIP>1）（圖3G），包括LysoPC (15:0)、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z))、PA (p -16:0 /18:2 (9Z,12Z))、反油酸、Nonadeca-10 (Z) -烯酸、二十碳烯酸和二十二碳六烯酸。

圖3 RK對2型糖尿病大鼠血清代謝組學的影響

（A）正離子模式下DM組和CON組之間的OPLS-DA得分圖，（B）負離子模式下DM組和CON組之間的OPLS-DA得分圖，（C）正離子模式下DM、CON、Met、RKL、RKM、RLH組的PCA評分圖，（D）負離子模式下DM、CON、Met、RKL、RKM、RLH組的PCA評分圖，（E）CON組、Met組、RKL組、RKM組和RKH組與DM組的維恩圖比較（p<0.05，VIP>1），(F) RK和Met處理改善的顯著代謝物熱圖，(G) RK處理改善的顯著代謝物熱圖，（H）CON/DM通路分析彙總圖（1-10代謝通路滿足p<0.05或影響值>0.1的條件），（I）RK/DM通路分析彙總圖（第1，2，5，6，9代謝途徑滿足p<0.05或影響值>0.1的條件）。

代謝途徑分析顯示重要代謝物在T2DM中起重要作用。如圖3H-I所示，T2DM患者有七條通路（p<0.05或影響值>0.1）受到顯著干擾，其中五條通路受RK處理的調節。這五條途徑涉及不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化。不飽和脂肪酸的生物合成途徑比RK調節的其他代謝途徑最重要（圖3I）。參與1-7代謝途徑的關鍵差異代謝物（VIP>1，與DM組相比p<0.05 CON）的詳細信息如圖S4所示。

圖4 RK對2型糖尿病大鼠腸道微生物羣的影響及其與重要代謝產物的相關性

（A）不同大鼠組腸道細菌屬水平的細菌分類學分析（每組n=6）。差異通過Mann–Whitney U檢驗進行評估。*與CON組相比，p<0.05，**p<0.01；#與DM組相比，p<0.05，##p<0.01。（B）19種重要代謝物的濃度與所有組中微生物屬的相對丰度之間的Spearman相關性。R值由漸變色表示，其中藍色和粉紅色單元格分別表示正相關和負相關；*p<0.05，**p<0.01。

4. RK對腸道菌羣的影響及其與重要代謝物的相關性

爲了研究RK對2型糖尿病大鼠腸道微生物羣的調節，我們通過16S rRNA基因的V4區分析結腸微生物羣組成。圖S5-6顯示了基於不同處理組的未加權unifrac距離的α多樣性指數和β多樣性分析。爲了分析微生物個體組成對RK干預的反應，我們進行了Mann–Whitney U檢驗，以測量處理組和DM組之間屬水平的細菌丰度（圖4A）。與DM組相比，RKM組的顫螺菌、粘螺旋菌的丰度明顯降低，密螺旋體和擬桿菌、考拉桿菌、琥珀酸弧菌屬、布勞特氏菌屬的丰度顯著增加（p<0.05）。RKL與四種細菌屬的調節有關（包括粘螺旋菌的數量減少，擬桿菌、考拉桿菌和布勞特氏菌屬的數量增加）。

爲了研究重要變化代謝物與腸道微生物羣的相關性，在所有組中，19種重要血清代謝物的濃度與微生物屬的相對丰度之間建立了Spearman相關分析（圖4B）。RKL、RKM或RKH減少的19種代謝物與擬桿菌的百分比呈負相關。L-棕櫚酰肉鹼、硬脂酰肉鹼、Arachidyl carnitine、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPC(15:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(17:0)、LysoPE(0:0/16:0)、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸(24:5n-6)、PA (P-16:0e/18:2(9Z,12Z))與粘螺旋菌呈顯著正相關。RKL、RKM或RKH減少的6種脂類代謝物（反式油酸、Nonadeca-10（Z）-烯酸、二十碳烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸（24:5n-6）、PA（P-16:0e/18:2（9Z，12Z））與考拉桿菌、琥珀酸弧菌屬、布勞特氏菌屬呈負相關。

圖5 RKM和RKP對2型糖尿病大鼠血糖穩態和血脂的影響

對（A）空腹血糖（FBG）、（B）糖化血清蛋白（GSP）、（C）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）曲線下葡萄糖面積（AUC）、（D）非酯化脂肪酸（NEFA）、（E）總膽固醇（TC）、（F）甘油三酯（TG）、（G）高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）和（H）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的影響。（I）胰島素濃度，（J）胰島素抵抗（HOMA-IR）。採用Tukey事後檢驗的單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。*與CON組相比，p<0.05，**p<0.01；#與DM組相比，p<0.05，##p<0.01。

5. RKP和RKM對葡萄糖穩態、血脂和胰島素抵抗的影響

爲了確定RK的主要功能性抗糖尿病成分，我們採用JK008樹脂吸附技術純化RK，獲得RKP。如表S3和圖S7所示，RKP由分子量爲1322、30和0.7 kDa的多糖部分和由巖藻糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：半乳糖醛酸=4.41:30.28:20.54:25.26:16.34:3.15的單糖組成。我們分別測定了粗多糖（RKM）的最佳劑量和低、中、高劑量純多糖（R KPL、RKPM、RKPH）對2型糖尿病大鼠葡萄糖穩態和血脂的影響（圖5A-H）。與RKM、RKPL和RKPM相比，RKPH具有最好的降低高血糖和血脂作用。此外，只有RKPH顯著減輕了胰島素抵抗（圖5I-J）。這些結果表明，RK的抗糖尿病作用可能主要由其純多糖部分驅動。

圖6 2型糖尿病大鼠腸道微生物羣與10項生化指標之間的Spearman相關性

R值由漸變色表示，其中藍色和粉紅色單元格分別表示正相關和負相關；*p<0.05，**p<0.01。

雖然我們之前的研究表明，RK對2型糖尿病小鼠有降糖作用，但RK對二型糖尿病大鼠腸道微生物羣和血清代謝的影響尚不清楚。本研究表明，RK可以通過調節腸道菌羣和宿主代謝，減輕2型糖尿病大鼠的高血糖和高血脂。高劑量的純化多糖（RKPH）比最佳劑量的粗多糖（KKM）具有更好的抗糖尿病作用，表明純多糖是其抗糖尿病作用的主要生物活性成分。

血清代謝物已知會影響宿主新陳代謝，因此可以反映宿主的健康狀況。RK處理改善了宿主的代謝途徑，包括不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化。五分之四的途徑屬於脂質代謝。許多前瞻性研究調查了脂質代謝產物與T2DM發病率之間的關係。飽和脂肪酸、酰基肉鹼、部分不飽和脂肪酸和磷脂在HFD誘導的肥胖小鼠中升高。在我們的研究中，RK處理降低了磷脂酰乙醇胺(即，LysoPE (0:0/18:1 (11Z))、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPE (0:0/20:3 (11Z,14Z,17Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z)))、飽和溶血磷脂酰膽鹼(即，LysoPC (14:0)、LysoPC (15:0)、LysoPC (16:0)、LysoPC(17:0)、LysoPC(18:0))，飽和溶血磷脂(即，LysoPC(0:0/16:0))、不飽和FA(即，二十二碳六烯酸、二十碳烯酸、反式油酸、Nonadeca 10 (Z) -烯酸、二十四碳五烯酸(24:5n-6))、不飽和溶血磷脂(即PA (P-16:0e/18:2 (9Z,12Z))(圖3E和S3)。

大量證據表明，腸道微生物羣的變化與T2DM密切相關。幾項研究表明，膳食多糖與腸道菌羣組成之間存在相互作用。由於食用安全性和病理活性，膳食多糖通過重塑腸道細菌組成在抗糖尿病活性中發揮關鍵作用。擬桿菌作爲人類腸道菌羣中的一個主要屬，具有廣泛的生物功能，可以代謝各種類型的膳食多糖。多項研究表明，多糖可以增加擬桿菌的丰度（p<0.05）。我們的結果表明，RKL、RKM通過增加擬桿菌的丰度來調節糖尿病大鼠的腸道菌羣。越來越多的證據表明，微生物組成可能影響宿主代謝，而Bacteroides plebeius的丰度與TC水平呈負相關。我們的數據清楚地表明，RK處理後擬桿菌屬的增加與2型糖尿病大鼠體內特定代謝物的激增顯著相關，例如飽和溶血磷脂酰膽鹼、肉鹼、磷脂酰乙醇胺和不飽和脂肪酸。我們還分析了所有組的2型糖尿病大鼠腸道微生物羣與10項生化指標之間的相關性（圖6）。值得注意的是，我們發現七個代謝參數，包括GSP、AUC、NEFA、TC、TG、HDL-C和LDL-C與腸道微生物羣中擬桿菌丰度的變化顯著負相關。這些結果表明，RKL、RKM處理後擬桿菌屬數量的增加可能影響T2DM的緩解。

考拉桿菌作爲一種天然的多糖發酵菌，與宿主的生理和代謝狀態密切相關。最近的研究也表明，琥珀酸病毒與總脂肪攝入量呈負相關。先前的研究表明，低脂肪飲食可以增加布勞特氏菌屬。此外，布勞特氏菌屬的丰度與內臟脂肪面積和三種血脂標誌物（TC、LDL-C、非HDL-C）顯著負相關。更重要的是，據報道，小檗鹼和二甲雙胍在改善大鼠高脂飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗過程中也會增加布勞特氏菌屬。最近的證據表明，布勞特氏菌屬丰度的增加與葡萄糖和脂質穩態的改善顯著正相關。與上述證據相一致，本研究表明，RKM處理增加了考拉桿菌、琥珀酸弧菌、布勞特氏菌屬的丰度。這三個屬與二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、反油酸、Nonadeca-10（Z）-烯酸、四碳五烯醇酸（24:5n-6）呈顯著負相關。值得注意的是，這五種代謝物都屬於不飽和脂肪酸。因此，RKM處理組中考拉桿菌、琥珀酸弧菌、布勞特氏菌屬的富集表明，RKM對腸道微生物羣的誘導作用可能與不飽和脂肪酸的代謝途徑有關。

結論

本研究中，我們發現從RK中分離出的400 mg/kg純化多糖(1322、30和0.7 kDa)比最佳劑量的粗多糖(RKM)具有更好的抗糖尿病作用。鑑於純多糖可能的抗糖尿病機制，各種研究爲利用天然多糖通過靶向腸道微生物羣來控制T2DM的發展提供了有力的證據。總之，本研究提供了證據支持RKP作爲2型糖尿病患者的有效膳食補充劑。未來的研究應側重於純多糖對特定細菌屬的影響，並明確瞭解多糖在改善脂質代謝過程中與有益細菌生長的構效關係。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814622025602

【福利時刻】畢業季找工作點擊鏈接，多家企業30W+年薪工作招聘任你選（趕緊點擊進入註冊，上傳簡歷吧~ ） 。