科學人／並非毫無用處！一文看次世代定序如何做到疾病預防與治療

行動基因生技股份有限公司NGS檢測過程。聯合報系資料照／記者曾原信攝影

隨着次世代定序（next generation sequencing, NGS）技術的發展，越來越多的研究證實，基因組中佔98%的非編碼區域，也有許多部份都扮演重要的基因調控角色，它們也如編碼區會受到相當程度的演化壓力，且具有高度的序列保守性，並非無用的垃圾。非編碼區域坐落着種類繁多且數量龐大的非編碼RNA （non-coding RNA, ncRNA）。由於強調個體差異的「精準醫療」（precision medicine）時代來臨，在研擬治療策略，考量個體間的特徵差異除了基因，還有非編碼區域位點和ncRNA也不可或缺。以下將介紹DNA、ncRNA、基因、疾病和精準醫療之間的關係。

龐大的非編碼RNA家族

核糖核酸（RNA）產物的集合體統稱爲轉錄體（transcriptome）。RNA產物的種類繁多（見33頁上方圖示），一般可粗分成：編碼RNA與非編碼RNA。編碼RNA也稱爲信使RNA（mRNA），會轉譯成蛋白質執行生物所需的功能；反之，ncRNA則不會（雖然極少數ncRNA在特殊情況下，也可能會轉譯成小片段有功能的蛋白質）。常見的「基因」指的是可轉錄出mRNA的遺傳序列，但廣泛的定義裡也包含ncRNA，爲了不造成混淆，本文中基因指的是mRNA。

ncRNA可細分多種，通常依序列長度是否達200個核苷酸爲界概分成：短鏈ncRNA與長鏈非編碼RNA（lncRNA）。前者包括：微RNA（micro RNA, miRNA）、轉移RNA（transfer RNA, tRNA）、核糖體RNA （ribosomal RNA, rRNA）、小干擾RNA （small interfering RNA, siRNA）、PIWI－交互作用RNA（Piwi-interaction RNA, piRNA）和小核RNA等。後者包括：不和基因重疊的長鏈ncRNA （long intergenic ncRNA, lincRNA）、與基因相似卻無法轉錄或轉譯的假基因（pseudogene）、能和mRNA序列互補的反義RNA （antisense RNA, asRNA）、分子間剪接RNA （trans-spliced RNA, ts-RNA ），以及由反式剪接（back-splicing）形成的環狀RNA （circular RNA, circRNA）等。

RNA產物的分類：此爲示意圖，光是ncRNA就種類繁多。圖／科學人雜誌提供

由上圖可看出，RNA家族浩繁，在此特別強調，序列長度的分界只是粗略的分類，也有某些lncRNA可能小於200個核苷酸。

ncRNA和基因的關係

雖然定義上的ncRNA不會轉譯成蛋白質，無法直接執行生物所需的功能，但越來越多ncRNA被證實，能借由和各式各樣的生物分子（可以是DNA、RNA或蛋白質）產生交互作用而調控目標基因的表現量，進而影響目標基因的功能。ncRNA調控基因的形式非常複雜且多樣，有興趣的讀者可進一步閱讀相關回顧性論文。在此僅依據ncRNA和其調控的目標基因在基因體序列的距離，極爲簡略地把調控基因的型式分成兩類：近端調控與遠端調控（見34頁圖）。

近端調控顧名思義，就是調控的ncRNA坐落在目標基因附近（通常在轉錄起始點5'端上游)，藉由和某些生物分子交互作用而調控此目標基因的mRNA表現量。遠端調控則是ncRNA和目標基因二者坐落在基因體序列上的距離很遠，甚至在不同染色體上。在此舉三個例子，第一個例子是lncRNA先調控某特定的轉錄因子（一種蛋白質），影響該轉錄因子原本調控的基因。第二個例子是miRNA利用其RNA序列的互補性，結合目標基因的mRNA，抑制其轉譯功能並進而降解，達到調節該目標基因的表現量。第三個例子是不同的ncRNA間相互調控，再影響其下游的基因表現量，例如有的lncRNA會和miRNA結合產生海綿效應（miRNA sponge），把miRNA吸住以影響miRNA的作用。最後影響原本miRNA所調控的基因。

在此特別介紹lncRNA中的circRNA，有別於其他類型的RNA屬於線性RNA，circRNA因其環狀的架構，比其他RNA穩定不易被降解。因此，一旦circRNA和miRNA交互作用產生海綿效應，影響該miRNA原本調控的基因的效應會更持久。我們可以想像circRNA、miRNA、mRNA之間，可以形成相當複雜且精巧的上下游調控關係。

各有巧妙：ncRNA的近端調控，lncRNA位於目標基因的上游附近，透過和生物分子交互作用來調控mRNA的表現量。遠端調控的（例一）中，lncRNA先和某轉錄因子交互作用，來調控該轉錄因子原本調控的mRNA；（例二）則是miRNA利用RNA序列的互補性結合mRNA，而造成mRNA降解；在（例三）中，miRNA是吸附在環狀RNA上（海綿效應）。進而影響miRNA原本調控的mRNA。

DNA、ncRNA、基因和性狀間的關係

近年的大型全基因體關聯分析研究（genome-wide association studies, GWAS）突飛猛進，搭配臨牀醫療等資料大數據分析，可望在DNA序列上找到與疾病預防、進程及治療相關的基因變異位點。

強強聯手：GWAS 分析可研究DNA變異位點與性狀或疾病的關聯（上圖）。這裡以自閉症和某DNA變異位點（基因型A/G）爲例，若自閉症患者都是A、健康者都是G，則此位點可做爲自閉症生物標誌（此爲示意圖，實際上疾病標誌不會如此明顯）。eQTL 分析則研究DNA變異位點與基因或ncRNA表現的關聯（下圖），亦即某DNA變異位點調控基因表現量，此圖中的三種基因型（AA、AG、GG）與基因表現量呈顯著正相關。

以自閉症的GWAS研究爲例（見上圖），研究單位蒐集有病症和無病症個體的血液樣本（樣本數皆達萬人以上）進行基因型鑑定（genotyping）或NGS基因體定序，找出基因變異位點，然後利用統計模組分析，篩出和自閉症有顯著相關的基因變異位點(GWAS變異位點)，這些位點便被視爲反應自閉症狀態的指標。如果這些GWAS變異位點坐落在已知的基因或ncRNA的範圍內，便能直接影響該基因、ncRNA的功能和調控效應，該基因或ncRNA即爲造成自閉症的高風險標的，科學家可對此進一步探討疾病機制。

但篩出的GWAS變異位點，很多不是坐落在已知的基因或ncRNA所在的範圍內。因此，想要了解GWAS變異位點如何影響該疾病的機制，比設想的更復雜。可能的方式是，除了對個體的血液樣本進行DNA變異位點分析外，也對個體的組織樣本（以自閉症研究爲例，是個體過世後的腦組織）抽取RNA進行NGS定序，再利用統計模組分析，篩出和基因或ncRNA的表現量高度相關的DNA變異位點，從而找到該變異位點所調控的下游基因或ncRNA。這樣的變異位點稱爲表現數量性狀基因座（expression quantitative trait loci, eQTL）分析（見35頁下圖）。

eQTL可能距離所調控的基因或ncRNA很近（cis效應），也很可能很遠（trans效應）。一般來說，cis效應會比trans效應強。可想而知，eQTL研究除了需要DNA定序資料外，還要來自同一個體中組織樣本的RNA資料，樣本收集的困難度大。

總結一下，GWAS分析DNA變異位點和性狀（或疾病）間的關係，eQTL分析DNA變異位點和表現型（例如基因或ncRNA表現量）的關係。進一步把二者的分析整合，即爲全轉錄體關聯分析研究（transcriptome-wide association study, TWAS）。如此，藉由GWAS變異位點定義顯著和性狀（或疾病）相關的基因。

如前面所述，ncRNA與基因間亦存在各種形式的交互作用，想要了解造成某個性狀（或疾病）的分子機制，就需要去釐清DNA變異位點、ncRNA、基因、性狀（或疾病）間調控的因果關係。這種推論各種因子和某性狀（或疾病）調控因果關係的研究稱爲因果生物學。過去，這樣的研究主要面臨三個挑戰：（1）缺乏同時具備同一個體的多體學資料（multi-omics data），如基因組和轉錄體定序等不同型態的資料；（2）因需同時具多種型態的資料，樣本數大小受限，容易產生統計偏差，評估的顯著性亦受限；（3）僅能評估各因子間的關係，難以推論因果。

前面的兩個挑戰的主要原因，是樣本來源與定序成本。隨着NGS技術進步，定序錯誤率降低、定序深度提高以及價格降低，針對大樣本數中的每一個體同時做多體學定序越來越可行。至於第三個挑戰，在於不同變數中，潛藏許多不易估計的干擾因子，容易造成評估失準。不過同樣地，當樣本數越大，更有機會藉由統計模組將潛在的干擾因子控制住，得到較可靠的因果推論。

NGS多體學資料和精準醫療

即使同一物種，不同個體間仍存在某種程度的基因組差異性，這種差異可能牽一髮而動全身，造成ncRNA基因間的調控關係發生變化，影響個體間的性狀、對疾病的反應（表現出來的症狀），以及對藥物施用後的療效不同。以癌症爲例，個體間的差異，有可能對於癌症患者有不同的預後與風險性，例如不同的復發時間、整體存活期、抗藥性等。因此，對於初次被診斷罹癌的病人，如果能預先評估其預後與風險性，便能協助醫師訂定治療策略，這就是精準醫療的精神。

因此，許多科學家嘗試建立預估癌症風險性的預測器。這裡我們以建立癌症復發預測器爲例，大略流程如下：首先需要一個訓練組（training set），這個訓練組需包括夠大的樣本數，每位病患的生理資料（包含：年齡、性別、人種等）、NGS多體學資料（例如DNA變異位點、ncRNA表現量、基因表現量）、以及預後情況（在此爲復發時間，time to relapse）（見下圖）。

精準預測：利用NGS多體學資料，可預測癌症復發。本例假設初始特徵數目爲5 萬，最後可篩選出和癌症復發高度相關的10個特徵。合格的預後模組必須在訓練組與測試組中都能準確預估復發時間。每位首次診斷出罹癌的病患，在預測器輸入10個特徵，便可得到復發風險係數與可能復發時間。其中預測正確率（AUC）等於1，代表100% 正確。

這些生理資料和NGS多體學資料便是所謂的「特徵」，我們可以設計統計模組或者加上機器學習技術，從幾萬筆的樣本資料中，找出和病患預後情況，最顯著相關的特徵。上圖的例子就是經過訓練找到一組具有十個特徵的復發預測器，爲了測試該預測器的正確性，會需要一組或多組兼具上述資料的病患樣本當測試組（testing set）。如果該預測器在訓練組和測試組「都」具有高正確率（超過70%，或者至少60%），該預測器的效能便可視爲具穩健性（robustness）。

最後當初次被診斷罹癌的病人，只要將該病患這十個特徵值輸入預測器，便可以預估其復發的風險係數以及可能的復發時間。當然，這個預測器的正確性會和訓練組的樣本大小、用以訓練的特徵種類與特徵個數、篩選顯著特徵的邏輯或演算法等相關。而實務上，由於個體間以及樣本來源（樣本取得／處理方式、定序策略等）差異，預測器要在不同測試組間都具高正確率是很困難的。特別強調，不同人種訓練出來的預測器差異可能很大，同一個預測器可能不適用於預測不同人種。這也是現在各國成立各自生物樣本庫的原因。

精準醫療勢在必行

生物體內如何執行功能，牽涉到極爲精密而錯綜複雜的調控網路，基因表現量受到DNA、RNA等許多層面上的因子所調控，基因和基因間往往也互相調控。網路中的任何環節，無論先天個體間差異或後天發生變化，都可能造成不一樣的性狀。藉由NGS多體學資料，設計大數據分析流程，建立預測模組，成爲精準醫療未來的必然趨勢。

DNA序列的集合體統稱爲基因組，而人類的基因組總長約有3 × 109個核苷酸（nucleotide）。第一個令人好奇的問題是，人類有多少個基因（gene）？在第一套人類全基因定序完成前，答案一直衆說紛紜。目前普遍認爲，人類約有2萬1000個可以轉譯成蛋白質的基因。緊接着另一個問題是，人類的基因組如此龐大，可編碼爲蛋白質的區域居然只佔2%，那其他部份是做什麼呢？

延伸閱讀

（本文出自2024.07.01《科學人》網站，未經同意禁止轉載。）