《Adv. Sci.》強黏附癒合紫草素水凝膠的糖尿病口腔潰瘍治療新方案！
口腔潰瘍的治療可以通過設計用於遞送藥物或細胞因子的多種生物材料來實現。然而，由於許多患者對這些物質的黏附性差、在口腔內停留時間短以及藥物療效欠佳，其治療效果往往受到限制。在本研究中，提出了一種新型的水凝膠貼片（FSH3），其由絲素蛋白/透明質酸基質組成，具有光敏粘附性，並摻入鐵離子/紫草素納米顆粒以增強癒合效果。該水凝膠通過簡單的局部注射形成，並在紫外光照射下固化，覆蓋在黏膜損傷表面形成粘附性屏障。隨後，FSH3表現出卓越的活性氧消除能力以及近紅外光熱殺菌活性，這些特性有助於消滅細菌並調節氧化水平，促進傷口從炎症階段向組織再生的轉變。在模擬口腔潰瘍的糖尿病大鼠模型中，FSH3通過調節受損組織的炎症環境、維持口腔微生物羣平衡以及加速上皮再生，顯著加快了癒合過程。總體而言，具有光敏特性的FSH3水凝膠在快速傷口修復方面展現了潛力，或將改變糖尿病口腔潰瘍的治療方法。
研究背景
口腔潰瘍，通常稱爲口腔黏膜損傷，是一種常見的口腔健康問題，表現爲口腔上皮組織的持續侵蝕或破壞。全球範圍內，超過25%的人曾經或正在經歷口腔潰瘍。如果不及時有效地治療，潰瘍的上皮層會進一步惡化，導致凹陷甚至組織壞死。這種退化嚴重影響咀嚼、吞嚥、說話，甚至消化等基本功能。此外，由於口腔黏膜的保護功能減弱，潰瘍容易受到細菌感染，這進一步阻礙了潰瘍的癒合過程。
爲了加速口腔潰瘍的癒合，已經開發了多種治療方案，如含有維生素的粉末、含有類黃酮和殼聚糖的商業口腔潰瘍貼片，以及生長因子凝膠等藥膏。然而，由於口腔環境動態且潮溼，這些治療手段在口腔黏膜表面的滯留時間通常不足2小時，因此治療效果有限。因此，開發具有優異粘附性能的生物材料對於改善口腔潰瘍的康復至關重要。
具有粘附特性的水凝膠貼片爲管理口腔潰瘍提供了一種可行的策略。通常，這類貼片的粘附技術可分爲物理粘附和化學粘附兩類，許多依靠從液體到固體的轉變來確保粘附。物理粘附通常使用氫鍵，但在潮溼的口腔環境中，因其常常失效而難以實現強力粘附。相反，通過與組織表面形成化學鍵的粘附方式，能夠提供更強的粘附力，並促進粘附部位的細胞遷移。
最近的研究表明，一種由o-硝基苯甲醛（NB）接枝透明質酸和雙鍵改性明膠組成的水凝膠在潮溼組織上具有強大的粘附力、低膨脹性、快速凝膠化和優異的生物相容性，這些特性對於唾液豐富的口腔環境應用至關重要。此外，這種水凝膠的主要成分明膠和透明質酸，與口腔黏膜的細胞外基質（ECM）的組成相似，後者主要由蛋白質和多糖構成。因此，這種模擬ECM的粘附性水凝膠可能是加速口腔黏膜損傷癒合的理想選擇。
在實現粘附特性之後，水凝膠敷料是否能有效執行其指定的生物功能，對於確保口腔潰瘍傷口的最佳修復至關重要。口腔潰瘍的癒合與皮膚傷口癒合類似，通常包括三個相互交織的階段：炎症、增生和重塑。在口腔黏膜的修復過程中，具有粘膜粘附性的水凝膠能夠自主調節傷口環境，控制細菌感染、炎症和宿主細胞活性，並在唾液環境中保護受損部位超過12小時，這對於支持口腔黏膜的再生至關重要。
近年來，各種生物活性材料已被引入水凝膠中用於皮膚傷口癒合。這些材料以其通過抗炎作用、殺菌以及促進生長因子生成來加速組織再生的能力而廣受認可，且無需添加細胞因子、細胞或藥物。然而，這些材料在潮溼環境中往往表現出不足的粘附強度和穩定性。此外，其複雜的結構設計、功能改造以及對外部干預的需求可能會阻礙其在臨牀環境中的應用。因此，開發具有強粘附力並具備有效生物癒合能力的口腔潰瘍貼片顯得尤爲重要。
本研究旨在通過開發一種類似ECM的水凝膠貼片（簡稱FSH3，見圖1）來有效治療口腔潰瘍。該貼片將具有治療效果的鐵離子/紫草素納米顆粒摻入由甲基丙烯酸酯絲素蛋白（SFMA）和NB接枝透明質酸（HA-NB）組成的生物分子基質中，該基質可通過紫外光（UV）固化並實現粘附。當暴露於365 nm紫外光時，水凝膠通過自由基聚合在傷口上形成保護層。此外，FSH3水凝膠對溼潤組織表現出較強的粘附性，這是由於HA-NB中的o-硝基苯分子在紫外光照射下轉化爲醛分子，通過與組織表面氨基形成亞胺鍵，促進快速且強力的組織粘附。
此外，嵌入FSH3水凝膠中的鐵離子/紫草素納米顆粒表現出優異的近紅外光熱殺菌特性，並能有效消除活性氧，這些特性對於消滅細菌和調節氧化狀態至關重要，從而幫助傷口從炎症期進入增生期。FSH3的三維多孔結構，由天然材料衍生物構成，作爲理想的細胞支架，能夠促進細胞粘附、增殖和血管生成，從而推動組織的重塑過程。在鏈脲佐菌素誘導的細菌感染大鼠模型中，FSH3有效加速了傷口修復。
研究結果
2.1 水凝膠的合成與粘附性能
圖1A展示了絲素蛋白（SF）與縮水甘油基甲基丙烯酸酯（GMA）相互作用，合成SFMA的過程。同時，NB的氨基（─NH2）通過酰胺鍵與透明質酸（HA）的羧基（─COOH）結合，生成HA-NB。在圖1B的1H NMR光譜中，顯示了SF分子鏈成功接枝甲基丙烯酸酯基團，SF甲基丙烯酸酯的接枝度約爲11.2%。在HA-NB的1H NMR光譜中，δ = 7.67 ppm 和 δ = 7.32 ppm的峰與NB分子a、b位置的質子相符，證明了o-硝基苯甲醛基團成功接枝到HA上，NB的接枝度約爲0.94%。此外，圖1C展示了HA-NB與SFMA反應在皮膚上形成水凝膠的過程。SFMA中的雙鍵在紫外光照射下發生聚合，形成交聯水凝膠網絡。同時，紫外光照射生成HA-NB上的醛基，這些醛基與SFMA的氨基以及皮膚表面形成動態共價鍵。FTIR光譜分析（圖S1，附加信息）顯示SFMA在1638 cm−1和1520 cm−1處有─CH2═CH2─的特徵吸收峰，HA-NB在1612和1404 cm−1處的峰則代表了─NB彎曲振動。此外，500至800 cm−1處吸收帶的顯著增加，表明C═O振動，進一步確認了FSH水凝膠的成功合成。
2.2 FeSK納米顆粒的合成與表徵
圖2A通過掃描電子顯微鏡（SEM）成像展示了FeSK的形貌特徵。FeSK納米顆粒形態均勻，呈現出獨立的納米球形，沒有明顯的聚集現象。動態光散射數據顯示，FeSK納米顆粒的平均粒徑爲356.8 ± 9.4 nm（圖2B）。此外，FeSK納米顆粒顯示出−34.6 mV的zeta電位（圖S2，附加信息），這可能與FeSK表面的多酚基團有關。接下來，系統研究了FeSK在近紅外（NIR）光下的光熱特性。我們通過808 nm激光輻射（1 W cm−2）照射不同濃度的FeSK，並用紅外相機實時捕捉其熱成像（圖S3，附加信息）。值得注意的是，與磷酸鹽緩衝液（PBS）相比，FeSK表現出顯著更高的溫度升高。此外，FeSK的光熱效率被測定爲14.42%（參考圖2H；圖S4，附加信息）。這些結果表明FeSK納米顆粒在光熱抗菌應用中具有優異的光熱穩定性和效率。
2.3 FSH水凝膠的合成與表徵
圖2D展示了隨着FeSK濃度增加，FSH水凝膠的溫度迅速升高。特別是，含有0.5 mg mL−1 FeSK的水凝膠在照射2分鐘後溫度達到60.4°C，而1 mg mL−1和2 mg mL−1濃度的水凝膠溫度分別達到了73.9°C和85.2°C。圖2E顯示了固定濃度FSH3水凝膠在增加激光功率密度後溫度的升高。此外，808 nm照射5分鐘後的熱成像與溫度上升曲線一致（圖2C）。通過自然光下放置約7分鐘讓水凝膠恢復至環境溫度來評估其光穩定性。結果表明，即使經過四個激光照射循環，水凝膠的溫度依然顯著上升，表明其具有出色的光熱穩定性（圖S5，附加信息）。
隨後，在50至600°C的空氣環境中進行了熱重分析（TGA），以評估新制備的FSH水凝膠的熱穩定性。圖S6顯示，樣品表現出三個明顯的分解溫度。最初，所有樣品的重量在200°C以下逐漸減少，主要是由於樣品中自由水的蒸發。接下來，在200至400°C之間，水凝膠的重量減少是由於聚合物側鏈基團的分解。超過400°C後，水凝膠開始氧化、分解和炭化，這與主要多糖鏈的斷裂有關。在600°C時，FSH1和FSH3水凝膠的總質量損失率分別爲63.5%和59.5%，這表明FeSK納米顆粒的引入增強了水凝膠支架的穩定性。
2.4 FSH水凝膠的體外生物相容性和抗氧化性能
我們進一步評估了FSH水凝膠在細胞水平的性能。作爲組織工程和傷口癒合的多功能敷料材料，其安全性至關重要。因此，首先對所製備的FSH水凝膠進行了細胞相容性測試。採用細胞計數試劑盒（CCK-8）實驗，評估了RS1、RAW 264.7和HGF細胞在分別培養1、3、5天后的細胞活力。圖3A-C顯示，FSH1和FSH3組的細胞活力均超過100%，表明水凝膠的毒性極低。經過3天的細胞培養後，對RS1、RAW 264.7和HGF細胞進行細胞活/死染色。在FSH組觀察到的綠色熒光與對照組相似，且幾乎沒有死亡細胞（圖3D）。接下來，通過溶血實驗測試了FSH水凝膠的血液相容性。圖S7（附加信息）顯示，雙蒸水（DDW）上清液呈鮮紅色，表明紅細胞溶解，隨後釋放出血紅蛋白。相反，PBS組和水凝膠組的上清液保持透明，溶血率均低於5%，證明其具有優異的血液相容性。綜上，FSH水凝膠表現出優異的生物相容性，使其成爲理想的生物醫學應用支架材料。
2.5 FSH水凝膠的機械性能和抗氧化特性
水凝膠敷料需要具備足夠的機械性能和柔韌性，以適應複雜和動態的傷口環境。利用DHR-2流變儀對FSH水凝膠的機械性能進行了廣泛分析。首先，通過0.1至10 Hz的振盪頻率測試，評估了水凝膠的頻率依賴性流變學響應（圖3F），發現貯藏模量（G'）在整個測試過程中始終高於損耗模量（G″），表現出穩定性。隨後，進行了應變掃描測試，分析了FSH水凝膠的線性粘彈性範圍（圖3G）。FSH3在應變超過100%時表現出一個轉變點，表明在應變超過100%時，水凝膠呈現出膠態。隨後，進行了振幅測試，以評估FSH樣品的自愈性能。圖3H顯示了在高應變（400%）下對水凝膠網絡的影響，隨後評估了低應變（1%）下的恢復性能。在400%應變下，G'顯著下降到G″以下，表明水凝膠網絡發生了斷裂。當應變恢復至1%時，G'和G″恢復到初始值，展示了水凝膠的快速自愈能力【25】。反覆的網絡恢復和崩潰循環進一步證明了水凝膠出色的自愈性能，這歸因於FSH3水凝膠中聚合物鏈間的Schiff鹼反應的動態可逆交聯。最後，剪切測試表明由於網絡中的動態物理交聯，水凝膠表現出剪切變稀特性，突顯了其有效的可注射性（圖3I）。圖S8（附加信息）顯示，水凝膠在紫外光照射後，其機械性能顯著增強，G'從10 Pa增加至1000 Pa左右，提升約100倍。此外，宏觀照片進一步證實了FSH水凝膠的可注射性和自修復特性。
2.6 細胞遷移和血管生成的體外檢測
我們採用細胞劃痕實驗評估了FSH水凝膠在氧化應激條件下對細胞遷移的影響。使用移液槍頭在RS1細胞的培養板底部劃痕，隨後加入H2O2和水凝膠，觀察在12小時和24小時孵育期間劃痕區的變化。圖4A顯示，隨着時間的推移，對照組的細胞有效遷移和增殖，在24小時內顯著縮短了遷移距離。相比之下，H2O2組的劃痕區域變化很小，細胞幾乎未遷移到劃痕區。處理過FSH3的細胞相較於H2O2組表現出增強的遷移能力，劃痕表面積逐步減少。最後剩餘的劃痕面積僅爲原始面積的27.25%（圖4B所示）。這些結果表明，合成的水凝膠通過中和外源氧化物，增強了細胞的抗氧化應激反應。
2.7 FSH水凝膠光熱抗菌性能的體外評估
感染顯著阻礙了傷口的完全癒合。在本研究中，我們首先採用瓊脂平板計數法探討了FSH系統的抗菌效果。對革蘭氏陽性菌（MRSA）和革蘭氏陰性菌（MRPA）進行了有無808 nm近紅外（NIR）激光照射下的抗菌實驗（圖5A）。水凝膠組能夠粘附部分細菌，在未照射NIR的情況下，MRSA的抗菌率爲14%（圖5B），MRPA爲18%（圖5C）。如預期所示，FSH3 + NIR組的抗菌率接近100%，表明使用NIR激光（808 nm，1 W cm−2，照射5分鐘）顯著增強了FSH3水凝膠的殺菌能力。爲了進一步驗證水凝膠對細菌生長的抑制效果，進行了細菌活/死染色實驗（圖5A）。與對照組相比，FSH1、FSH3和FSH1 + NIR處理組的綠色熒光顯著減少，表明水凝膠具有捕獲細菌的能力（圖5D、E）。特別是FSH3 + NIR組顯示出最強烈的紅色熒光，這是因爲碘化丙啶（PI）滲透到受損的細菌膜內，使細菌染成紅色。
2.8 FSH3 水凝膠對 MRSA 感染糖尿病背部皮膚創傷的體內癒合效果
在獲得體外數據後，我們進一步評估了 FSH3 水凝膠在體內促進糖尿病傷口癒合的潛力。首先，研究重點放在 FSH3 水凝膠的止血能力上。快速止血對於傷口的高質量修復至關重要。因此，我們在水凝膠基質中引入了具有光活性粘附性能的 NB 組分，以實現快速止血。FSH3 水凝膠的止血效果通過大鼠肝臟和尾部止血模型進行評估。在肝臟止血模型中（圖 S15，補充信息），接受 FSH3 處理的大鼠表現出最顯著的止血效果，幾乎沒有可見的出血，而其他組則存在明顯的出血。定量分析顯示，空白組（199.2 mg）和紗布組（132.7 mg）的失血量顯著高於 FSH3 水凝膠組（11.4 mg）。在尾部止血模型（圖 S16，補充信息）中得到了類似的結果，進一步證實了 FSH3 水凝膠在體內優異的止血效果。
2.9 FSH3 水凝膠對 MRSA 感染糖尿病口腔潰瘍的體內癒合效果
在確認 FSH3 水凝膠對背部皮膚傷口的癒合作用後，研究重點轉向構建口腔潰瘍模型，以進一步評估其癒合能力。該模型的構建方法詳見圖7A。在向大鼠黏膜塗抹冰醋酸後，潰瘍部位迅速出現發白反應。除了水凝膠治療組外，還包括 PBS 處理的陰性對照組和作爲陽性對照的利多卡因組。圖7B顯示，術後第一天，所有大鼠組的口腔中央均出現硬質潰瘍，周圍黏膜紅腫並伴有黃膜。水凝膠治療兩天後，假膜厚度和潰瘍面積均有減少。四天後，對照組仍可見假膜殘留，而利多卡因和 FSH3 組的黏膜紅腫明顯減輕，FSH3 + NIR 組的潰瘍面積最小。到第五天，FSH3 + NIR 組的潰瘍幾乎完全癒合。
2.10 FSH3 水凝膠的抗菌機制的轉錄組學評估
宏基因組學通過基因組學方法和生物信息學工具探討整個微生物羣落的遺傳內容。我們通過 RNA 測序分析了 FSH3 + NIR 的抗菌效果，研究了 MRSA 在暴露於 FSH3 + NIR 後的差異表達基因（DEGs）。樣品中的基因表達數量和數值分佈如圖 8A 所示。主成分分析確認了組間差異的內部一致性，從而驗證了 RNA 測序結果（圖 8B）。
來源：青納
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